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            肉蓯蓉提取物對帕金森病細胞損傷模型的保護作用
            帕金森?。≒arkinson‘s disease, PD)是中樞神經系統進行性變性疾病。一旦出現臨床癥狀,其黑質紋狀體系統多巴胺神經元已經減少了60%~80%.盡管神經科學家采取包括左旋多巴制劑在內的各種治療方法,但目前所有的研究都提示無法阻止其進展。生長抑制和DNA損傷誘導基因153(growth arrest and DNA damageinduced gene 153, GADD153)是調控細胞凋亡的一種重要蛋白,在細胞內質網應激等應激狀態下大量表達并轉位于細胞核[1]。本研究觀察了肉蓯蓉提取物對1甲基4苯基吡啶離子(1methyl4phenylpyridinium ion, MPP+)介導的SHSY5Y多巴胺能細胞系損傷的保護作用及對GADD153表達的影響,并探討了其對帕金森病的神經保護作用。

              1  材料與方法

              1.1  材料  肉蓯蓉提取物,上海市東方科技公司產品,PBS稀釋成10 mg/ml,22 μm濾膜過濾滅菌;MPP+,Sigma公司產品,無菌蒸餾水稀釋成4 mol/L;胎牛血清、達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco‘s modified eagle’s medium, DMEM)、胰蛋白酶,均為Gibco公司產品;GADD153小鼠抗人單克隆抗體,Santa Cruz公司產品;小鼠抗人βactin單克隆抗體,Sigma公司產品;甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT),荷蘭Duchefa公司產品;反轉錄試劑盒(reverse transcriptasepolymerase chain reaction, RTPCR),MBI公司產品;SHSY5Y細胞,復旦大學神經生物學國家重點實驗室黃芳老師惠贈。

              1.2  實驗方法

              1.2.1  細胞培養及分組  SHSY5Y細胞每2~3 d用10% DMEM培養液換液1次。待細胞增長至80%融合時,用0.25%胰酶消化細胞,按1×105分瓶傳代,置于5% CO2的細胞培養箱中。實驗用細胞分為對照組、MPP+組和肉蓯蓉提取物不同濃度組。用DMEM培養液將MPP+按1∶10梯度稀釋成400 mmol/L,按1∶100體積比例加入96孔板或6孔板中,使MPP+終濃度分別為0.25、0.5、1、2和4 mmol/L.肉蓯蓉提取物用DMEM培養液按1∶10梯度稀釋成1 mg/ml與10 μg/ml兩個工作濃度。按1∶100加入96孔板或6孔板中,使終濃度分別為1、10和100 μg/ml.6孔板每孔總體積為2 ml,96孔板每孔總體積為200 μl.每項相同實驗均重復3次。

              1.2.2  MTT檢測細胞活性

              1.2.2.1  MPP+對SHSY5Y細胞存活率的影響  1×104密度SHSY5Y細胞200 μl接種于96孔板,24 h后換含MPP+終濃度分別為0.25、0.5、1、2和4 mmol/L的培養液,每濃度3復孔,置于5% CO2培養箱37 ℃孵育,分別于6、12、24和48 h時各孔加入MTT 20 μl,繼續孵育4 h取出培養板。吸棄培養液,每孔加入二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)150 μl充分震蕩10 min,待藍色顆粒完全溶解后用全自動酶標儀(Biorad產品)570 nm處測定吸光度值。

              1.2.2.2  肉蓯蓉提取物對MPP+介導的SHSY5Y細胞損傷的影響  終濃度1 mmol/L MPP+與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100 μg/ml同時加入96孔板置5% CO2培養箱37 ℃孵育48 h.其余步驟同1.2.2.1.

              1.2.3  RTPCR檢測GADD153的mRNA表達  終濃度1 mmol/L MPP+與肉蓯蓉提取物分別為1、 10和100 μg/ml,同時加入6孔板置5% CO2培養箱37 ℃孵育48 h.取出6孔培養板,PBS沖洗,按Trizol法提取總RNA.取1 μg RNA,按反轉錄試劑盒說明進行逆轉錄。聚合酶鏈反應總體積為25 μl.引物序列為:GADD153上游引物,5‘GCACCTCCCAGAGCCCTCACTCTCC3’;下游引物,5‘GTCTACTCCAAGCCTTCCCCCTGCG3’;βactin上游引物,5‘ATCGTGGGCCGCCCTAGGCAC3’;下游引物,5‘TGGCCTTAGGGTTCAGA GGGGC3’。擴增目的產物的長度分別為422 bp和244 bp.94 ℃預變性5 min.循環參數為:95 ℃變性0.5 min,60 ℃退火0.5 min,72 ℃延伸1 min,共35個循環。取PCR產物4 μl,電泳后拍照。

              1.2.4  Western blotting檢測GADD153蛋白表達  終濃度1 mmol/L MPP+與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100 μg/ml,同時加入6孔板置5% CO2培養箱37 ℃孵育48 h.取出6孔培養板,PBS沖洗,加入60 μl蛋白裂解液裂解,超聲震蕩,100 ℃變性10 min.用Lowry法測定樣品蛋白濃度。電泳:積層膠60 V 30min,分離膠120 V 90 min;PVDF膜轉膜110 V 100 min.加1∶50小鼠抗人GADD153單克隆抗體,4 ℃過夜。TBST溶液洗滌3次,10 min/次,加含HRP的兔抗小鼠二抗室溫孵育2 h,化學發光法顯影X膠片。膠片用Alpha Image 950自動掃膠系統得到條帶灰度值。每個樣本的免疫印跡條帶均與同一樣本的βactin比較后作統計學分析。

              1.3  統計學方法  采用SPSS 11.5軟件進行單因素方差分析。計量資料數據用x±s表示。

              2  結果

              2.1  MPP+對SHSY5Y細胞存活率的影響  不同濃度MPP+作用SHSY5Y細胞后,細胞存活率隨MPP+的濃度增加而降低;MPP+ 1 mmol/L濃度狀態下細胞存活率隨時間增長而降低。呈現明顯的量效與時效關系。見圖1.其中MPP+ 1 mmol/L組在48 h存活率為(45.30±3.21)%,低于50%.故選用1 mmol/L MPP+作為制作帕金森病細胞模型的處理劑量。

              圖1  不同濃度MPP+對SHSY5Y存活率的影響(略)

              Figure 1  Effects of different concentrations of MPP+ on cell viability of SHSY5Y

              2.2  肉蓯蓉提取物對1 mmol/L MPP+介導的SHSY5Y細胞存活率的影響  肉蓯蓉提取物對MPP+介導的損傷有明顯的保護作用。保護作用隨濃度增加而加強。MPP+ 1 mmol/L處理的細胞48 h存活率為(45.30±3.21)%,1 μg/ml肉蓯蓉提取物處理的細胞存活率為(85.97±3.41)%,10 μg/ml為(129.97±4.84)%,100 μg/ml為(164.10±3.91)%,三種濃度與MPP+ 1 mmol/L對照處理比較,細胞存活率差異有統計學意義(P<0.01)。提示肉蓯蓉提取物不僅有較好的神經保護作用,而且還可能有促進細胞增殖的作用。見圖2.

              2.3  肉蓯蓉提取物對MPP+介導的帕金森病細胞模型GADD153 mRNA表達的影響  MPP+ 1 mmol/L處理SHSY5Y細胞后,在膠上觀察到GADD153 mRNA水平明顯較對照組明亮,統計出的結果也表明兩者之間差異有統計學意義(P<0.01)。肉蓯蓉提取物組與MPP+ 1 mmol/L處理組相比,GADD153 mRNA水平不僅在膠上顯示出其隨著肉蓯蓉提取物濃度的增加而條帶逐漸變暗,對其掃描統計分析出的結果也進一步證實,肉蓯蓉組GADD153的mRNA水平明顯降低(P<0.01),且這種降低明顯呈肉蓯蓉劑量的依賴關系。見圖3.

              圖2  肉蓯蓉提取物對MPP+介導的帕金森病細胞模型的保護作用(略)

              Figure 2  Protective effect of Cistanche extracts on MPP+induced PD cellular model

              All the three concentrations of Cistanche extracts (CE) had a protective role on the 1 mmol/L MPP+ treatment. MPP+treated cells had a lower viability vs control group, and Cistanche extracts groups exhibited higher viability vs MPP+ group. **P<0.01, vs MPP+ group; △△P<0.01, vs control group.

              圖3  肉蓯蓉提取物對MPP+介導的帕金森病細胞模型GADD153 mRNA表達的影響

              Figure 3  Effects of different concentrations of Cistanche extracts on mRNA expression of GADD153 of MPP+induced PD cellular model

              mRNA expression of GADD153 in control group, MPP+ group (M), Cistanche extracts 1 μg/ml  group (CE1), 10 μg/ml group (CE2) and 100 μg/ml group (CE3)。 mRNA expression of GADD153 increased to a significant level after being treated by 1 mmol/L MPP+, while Cistanche extracts showed excellent capability of decreasing GADD153 mRNA expression.**P<0.01, vs MPP+ group; △△P<0.01, vs control group.

              2.4  肉蓯蓉提取物對MPP+介導的帕金森病細胞模型GADD153 蛋白表達的影響  MPP+ 1 mmol/L處理48 h后,Western blotting結果表明GADD153大量表達,膠片上的MPP +組印跡的著色明顯較對照組深,且這個結果與掃描統計后的分析結果一致(P<0.01),而1、10和100 μg/ml 肉蓯蓉提取物卻逐漸降低了GADD153蛋白的表達,且這種表達與MPP+組相比差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4.

              圖4  肉蓯蓉提取物對MPP+介導的帕金森病細胞模型GADD153 蛋白表達的影響(略)

              Figure 4  Effects of different concentrations of Cistanche extracts on protein expression of GADD153 of MPP+induced PD cellular model

              Expression of GADD153 protein in control group, MPP+treated cells (M), Cistanche extracts 1 μg/ml  (CE1), 10 μg/ml  (CE2) and 100 μg/ml  (CE3)pretreated groups. GADD153 protein expression of MPP+treated cells increased to a significant level, and Cistanche extracts pretreatment decreased the protein expression by a significant level. **P<0.01, vs MPP+ group; △△P<0.01, vs control group.

              3  討論

              以往的研究表明內質網應激在帕金森病的發病機制中占有很重要的地位[2, 3]。在內質網應激過程中,ATF6,IRE1和PERK三條通路都可以直接或間接地激活GADD153,進而使正常細胞內低水平表達的GADD153過量表達并轉位于細胞核,從而導致細胞凋亡[4,5]。而GADD153敲除小鼠能減少甚至阻止內質網應激和神經營養因子剝奪所導致的細胞凋亡[6, 7]。帕金森病的典型病理表現是中腦多巴胺能神經元的減少,而這種減少目前認為多與細胞凋亡有關[8]。我們的研究發現,在1 mmol/L MPP+處理SHSY5Y細胞48 h后,細胞的存活率已經低于50%,而此時GADD153的mRNA和蛋白水平與對照組相比明顯增加(P<0.01),這一結果也與Conn等[9]的發現相一致。因而GADD153的升高與細胞損傷之間有著緊密的聯系。肉蓯蓉提取物是從管花肉蓯蓉中分離、純化的一種化合物。中醫認為肉蓯蓉具有補腎陽、益精血、潤腸通便的功效,主治男子陽痿、女子不孕、血枯便秘等證,有“沙漠人參”的美譽。以往的研究表明肉蓯蓉可以提高多種中樞神經遞質的含量,具有很強的抗氧化作用,還可延長動物壽命和抗衰老。而對肉蓯蓉提取物的研究也表明肉蓯蓉的提取物具有抗凋亡的作用[10~12]。本實驗的MTT結果表明1、10和100 μg/ml 肉蓯蓉提取物的細胞存活率均比MPP+組明顯增高(P<0.01),而且細胞存活率與肉蓯蓉提取物濃度呈劑量依賴關系。因此我們的結果表明肉蓯蓉提取物對MPP+介導的損傷具有保護作用。RTPCR和Western blotting的結果顯示,GADD153的表達與對照組相比也明顯降低。其中在肉蓯蓉提取物最高濃度組(100 μg/ml )GADD153 mRNA水平降到了最低(P<0.01),Western blotting的結果也發現GADD153的蛋白表達同時降到了最低(P<0.01)?;谏鲜鼋Y果,我們認為肉蓯蓉提取物對MPP+介導的SHSY5Y細胞損傷模型的保護作用可能是通過調控GADD153來實現的。

             

             

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